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明膠酶譜實驗是分子生物學(xué)的常用實驗技術(shù)之一
點擊次數(shù)：877 更新時間：2022-12-23
細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）是由大分子構(gòu)成的錯綜復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)。為細(xì)胞的生存及活動提供適宜的場所，并通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)影響細(xì)胞的形狀、代謝、功能、遷移、增殖和分化。
基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）可以降解細(xì)胞外基質(zhì)成份，需要Ca2+、Zn2+等金屬離子作為輔助因子，是一組具有許多共同生化性質(zhì)的可降解細(xì)胞外基質(zhì)的酶?；|(zhì)金屬蛋白酶2（MMP2）主要降解IV型膠原，基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）可以降解彈性蛋白、膠原蛋白、明膠和纖維蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)的成分?；|(zhì)金屬蛋白酶的失調(diào)是多種疾病發(fā)生、發(fā)展的重要機(jī)制之一。
明膠酶譜實驗可以檢測MMP2和MMP9的活性，是分子生物學(xué)的常用實驗技術(shù)之一。先將樣品進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE，含0.1%明膠）電泳分離，然后在有二價金屬離子存在的緩沖系統(tǒng)中使樣品中的MMP-2和MMP-9恢復(fù)活性，在各自的遷移位置水解凝膠里的明膠，最后用考馬斯亮藍(lán)將凝膠染色，再脫色，在藍(lán)色背景下可出現(xiàn)白色條帶，條帶的強(qiáng)弱與MMP-2和MMP-9活性成正比。
酶譜法的基本過程是先將樣品進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE，含0.1％明膠）電泳分離，然后在有二價金屬離子存在的緩沖系統(tǒng)中使樣品中的MMP-2和MMP-9恢復(fù)活性，在各自的遷移位置水解凝膠里的明膠，最后用考馬斯亮藍(lán)將凝膠染色，再脫色，在藍(lán)色背景下可出現(xiàn)白色條帶，條帶的強(qiáng)弱與MMP-2和MMP-9活性成正比。
復(fù)性原理：在電泳過程中，SDS與樣品中的MMPs結(jié)合（當(dāng)然是可逆性結(jié)合），破壞其氫鍵、疏水鍵而使MMPs不能發(fā)揮其分解明膠的作用，而只有當(dāng)將膠置Trition中洗脫（最好是放在搖床上搖，30min／次，做2次或15min/次，4次。靜置于Trition中是不妥的。）時，由于SDS被Trition結(jié)合而去除，從而使MMPs恢復(fù)了活性。
